Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aerugiosa ГИСК 453, АТСС 9027 Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р (FDA 209-Р) Сandida albicans АТСС 885-653
Aspergillus niger
BKM F-1119
Проведение испытания
Перед определением антимикробного действия культуры бактерий отсевают на скошенную в пробирках плотную питательную среду №1 и инкубируют при температуре от 300С до 350С в течение 18-24 часов.
Культуры грибов выращивают на скошенной плотной питательной среде №2 при температуре от 200С до 25 0С, С. аlbicans - 48 часов, А. niger - 7 суток.
Со скошенного агара культуры бактерий и С. аlbicans смывают раствором натрия хлорида 0,9%, культуру А. niger - этим же раствором с 0,05% полисорбата 80. Полученные суспензии разводят до концентрации 103 КОЕ/мл для культур бактерий и 103 - 104 КОЕ/мл для культур грибов.
Определение антимикробного действия для водорастворимых лекар-стенных средств
Готовят разведения лекарственного средства 1:10; 1:20; 1:50 (при необходимости ряд разведений может быть продолжен), используя фосфатный буферный раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5 % по-лисорбата 80).
Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в чашки Петри диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0,2 мл взвеси культуры В. сereus, а в другие - по 0,2 мл культуры С. albicans и А. niger. В чашки с В. сereus вносят по 15-20 мл расплавленной среды № 1 при температуре (45 - 50) 0С, в чашки с культурами С. albicans и А. niger - то же количество среды № 2.
Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - № 3 и № 8. В пробирки со средой № 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры Ехоіі, в пробирки со средой № 8 - по 1 мл взвеси культур Р.aeruginosa и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведения лекарственного средства вносят такое же количество буферного раствора.
Посевы на средах № 1, 3, 8, инкубируют при температуре от 300С до 35 0С в течение 2 суток (среды № 3, № 8) и 5 суток (среда № 1). Посевы на среде № 2 инкубируют при температуре от 200С до 250С в течение 5 суток. В случае, если при внесении лекарственного средства в жидкие питательные среды (№ 3, № 8) образуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды № 3 на среду № 4 (агар Эндо), а со среды № 8 - на среды № 9 и № 10. При росте типичных колоний Ехоіі (среда № 4), Р.aeruginosa (среда № 9) и S.aureus (среда № 10) отмечают наличие роста тест-микроорганизма.
Определение антимикробного действия для водонерастворимых лекарственных средств (метод репликаций).
В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого лекарственного средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для получения разведения. В чашки Петри (как в эксперименте, так и в контроле) добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до (45 - 50) 0С среды № 1, в другие - такое же количество среды № 2 и быстро пере-
мешивают. После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды.
На поверхность агара бактериологической петлей или репликатором наносят бляшками инокулят каждого тест-штамма бактерий и грибов на среды № 1 и № 2 соответственно.
Чашки со средой № 1 инкубируют при температуре от 300С до 350С в течение 48 часов. Чашки со средой № 2 инкубируют при температуре от 200С до 250С в течение 3-5 суток.
Учет результатов
После окончания сроков инкубации посевов (появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках без лекарственного средства) отмечают наличие или отсутствие роста тест-штаммов бактерий и грибов на средах, в которые вносили различные разведения лекарственного средства.
Отсутствие роста тест-микроорганизма на среде с препаратом свидетельствует о том, что исследуемый препарат в данном разведении обладает антимикробным действием в отношении определенного тест-микроорганизма.
НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АГЕНТЫ
Для нейтрализации активности антимикробных компонентов могут использоваться нейтрализующие агенты. Они могут быть добавлены к буферизированному раствору хлорида натрия и пептона рН 7,0, предпочтительно, перед стерилизацией. В случае применения нейтрализующих агентов должна быть показана их эффективность и нетоксичность в отношении микроорганизмов.
Типичная нейтрализующая жидкость имеет следующий состав:
Полисорбат 80 30 г
Лецитин (яичный) 3 г
Гистидина гидрохлорид 1 г
Пептон (мясной или казеиновый) 1 г
Натрия хлорид 4,3 г
Калия дигидрофосфат 3,6 г
Натрия гидрофосфата дигидрат 7,2 г
Вода очищенная 1000 мл
Раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1210С в течение 15 мин.
Если нейтрализующая способность раствора недостаточна, концентрация полисорбата 80 или лецитина может быть увеличена. Кроме того, могут быть добавлены нейтрализаторы, перечисленные в Таблице 2.6.13.-3.
